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落射荧光显微镜观察方法介绍及注意事项

  利用荧光显微镜进行落射荧光观察,其操作是基于上述倒置显微镜的正确调校后,方可进行荧光装置的调校操作,以实现良好的荧光显微观察功能。同时荧光显微观察时,要注意以下方面:

(1) 合理选择荧光激发/发射滤色片组与拟使用的荧光色素或样品的荧光特性。  

(2) 在光学系统中不应放置自发荧光的样品或装置,如油镜观察时,使用香柏油会自发青色荧光。

(3) 为了有效避免因过度激发照射而产生荧光淬灭,建议在启动荧光电源5~10分后,待荧光光源趋于稳定时,再装载样品进行观察。调焦或寻找目标像的过程中,减小光阑孔径或加入磨砂玻璃片。

(4)为了延长汞灯使用寿命,电源箱不可频繁开关,正常启动15分钟后方可关闭,再次启动至少需要等待10分钟(使水银蒸汽冷却至原态),否则会影响汞灯寿命与损坏电源箱。

 

       下述操作介绍主要包括荧光照明器各部件,不涉及其相关原理:

 

一. 荧光装置的设置与调整

  荧光显微镜的重要部件是荧光激发滤色片组,每一个组件包括两种不同波段的激发滤色片,分为蓝(B)、绿(G)激发组合,紫(V)、紫外(UV)激发组合,在激发滤色片组件的内侧面贴有类型标识。在激发滤色片组件的外侧面印有型号标识,使用时,要根据所观察的样品或荧光色素合理选择,否则会影响后述操作或仪器正常荧光观察。

(1) 如果在仪器安装时未安装荧光激发滤色片组件,请取下粘在主机左侧激发滤色片插槽上的防尘胶带,将所需的激发滤色片组正确插入激发滤色片插槽内。插入过程中将会出现两次明显定位的“咔哒”声,分别表示两种激发滤色片的光学定位中心。请确认激发滤色片是否处于定位位置,否则会使其偏离光路中心而影响观察。

(2) 关闭倒置透射照明系统(关闭卤素灯照明),将主机上的电源开关拨至“0”位。如不关闭倒置透射照明系统,将会影响落射荧光观察。此时不需放置任何切片或标本在载物台上。

(3) 推开荧光挡光拉板

      荧光挡光拉板主要是用于荧光照明遮挡与衰减,以防止激发光长时间或高强度照明标本,从而使标本发生改变或破坏其组织性能。荧光挡光拉板有三个定位点,即通光孔、衰减磨砂孔、挡光位,插入过中有明显的定位。请将拉板推至通光位置。

(4) 开启荧光电源箱

     确认电源箱输入端与输出端连接可靠后,可开启电源箱开关至“-”,此时电源箱指示灯呈亮红色,散热风扇运转正常。为电流微调旋钮。

(5) 打开视场光阑

  在目视观察时,可拨动视场光阑1调节手柄,使视场光阑孔径开至最大。如在摄影摄像时,为了减少视场中杂散光晕的影响,一般将光阑适当关小至全视场的60~70%拨动视场光阑调节手柄,将视场光阑孔径开至最大。

 

二. 检查落射荧光光路的对中性

本仪器出厂前已校正好落射荧光光学系统的中心,但由于包装时已将汞灯取下独立包装,因此当重新安装汞灯后,可能会出现汞灯发光体中心偏离光路中心,使用前需要进行检验与校正。

(1)请准备一张白纸(约40mmX50mm),将小白纸置于载物台上。

(2)取出其中一个物镜,将转换器无物镜的安装孔位转入光路中。此时可以在白纸上呈现一个明亮的光斑,内部有呈蝴蝶结状的灯丝像。

(3)如果灯丝像不清晰,可以调节落射器集光镜调节手柄1,使灯丝像清晰。

(4)如果蝴蝶结状的灯丝像偏离明亮光斑的中心或倾斜,则需要调节汞灯的中心。可以通过调节手轮2与3调节汞灯的中心,手轮2用于左右调节,手轮3用于上下调节。

(5)重新安装物镜并转动转换器,将物镜转入光路中。现在可以利用本仪器进行荧光显微观察。

 

 

三.荧光显微观察

(1) 放置荧光显微观察标本

   本仪器配置两块或三块(选购)培养皿托板,请选合适的培养皿托板并将其放置在载物台移动尺的托板槽内,然后将标本切片或培养皿放置在托板槽内。

(2) 如果需要放置高的培养皿,可能需要将载物台移动尺拆卸下来。此时需旋松聚光镜升降装置 固紧手轮,旋转聚光镜升降装置使其摆出光路(大于90度)。用扁形“一”字螺丝刀拧松载物台下的三个螺钉,拆下载物台移动尺,将移动尺平放于工作台上。将高的培养皿直接放置在固定载物台上,为了不影响观察,请将聚光镜升降装置固紧手轮固紧。

(3) 调节粗微动手轮使标本像清晰,如果调焦后标本像不清晰或视场内像的亮度很暗,这有可能是所使用的荧光激发滤色组与荧光色素不匹配,请根据所需要观察的标本样品特性选择匹配的荧光激发滤色片组。

(4) 如果操作过程中需要暂停一段时间,但又不想关闭荧光电源箱,这种情况下需要将荧光挡光拉板推至挡光位,以保护荧光标本不受长时间激发而衰减或淬灭。


落射荧光显微镜观察方法介绍及注意事项

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